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植物組培培養基本操作步驟

  組織培養的步驟

  培養基配制

  配制培養基有兩種方法可以選擇,一是購買(mǎi)培養基中所有化學(xué)藥品,按照需要自己配制;二是購買(mǎi)商品的混合好的培養基基本成分粉劑,如MS、B5等。自己配制可以節約費用,但浪費時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問(wèn)題,給實(shí)驗帶來(lái)麻煩。目前國內的情況看,多數還是自己配制。

  1、配制幾種母液

  一般配制成100倍MS有機母液。配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中。

  1.1配制MS大量元素母液

  1.2配制MS微量元素母液

  1.3配制MS有機母液

  1.4配制MS鐵鹽母液

  MS母液有5種大量元素母液,加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液,共8種母液。

  2、激素母液的配制

  各種生長(cháng)素和細胞分裂素要單獨配制,不能混合在一起,生長(cháng)素類(lèi)一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解,細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解,然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

  3、配制培養基

  以配置1L MS培養基為例,按順序進(jìn)行如下操作:

  3.1先在燒杯中放入一些蒸餾水。

  3.2分別取上面八種母液10ml倒入。

  3.3一般稱(chēng)取30g蔗糖倒入,攪拌溶解。

  3.4加蒸餾水用量筒定溶至1L。

  3.5按設計好的方案添加各種激素,由于激素的用量很小,而且激素對組培植物的生長(cháng)至關(guān)重要。所以有條件的話(huà)好用微量可調移液器吸取,減少誤差。

  3.6用精密試紙或酸度計調整PH至5.7~5.8。(有條件的話(huà)使用酸度計,比較精確) 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來(lái)調溶液PH值。

  1當量HCL配制:用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

  1當量NaOH配制:稱(chēng)取NaOH 4g 配成100ml溶液。

  3.7稱(chēng)取5g左右瓊脂粉(質(zhì)量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在電爐上加熱至沸騰,直到瓊脂粉熔化。

  3.8稍微冷卻后,分裝入培養容器中。無(wú)蓋的培養容器要用封口膜或牛皮紙封口,用橡皮筋或繩子扎緊。

  3.9放入消毒滅菌鍋滅菌,滅菌20分鐘左右。

  3.10滅菌后從滅菌鍋中取出培養基,平放在實(shí)驗臺上令其冷卻凝固。

  滅菌

  滅菌是組織培養重要的工作之一。初學(xué)者要清楚有菌和無(wú)菌的范疇。有菌的范疇是:凡是暴露在空氣中的物體,接觸自然水源的物體,至少它的表面都是有菌的。依此觀(guān)點(diǎn),無(wú)菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內表,如整個(gè)消化道、呼吸道,即我們呼出的氣體、培養容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。

  這里所指的菌,包括細菌、真菌、放線(xiàn)菌、藻類(lèi)及其他微生物。菌的特點(diǎn)是:極小,肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在,無(wú)時(shí)不有,無(wú)孔不入。在自然條件下忍耐力強,生活條件要求簡(jiǎn)單,繁殖力極強,條件適宜時(shí)便可大量滋生。

  無(wú)菌的范疇是:經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體,經(jīng)其他物理或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體,高層大氣、巖石內部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內部,強酸強堿,化學(xué)元素滅菌劑等表面和內部都是無(wú)菌的。

  滅菌是指用物理或化學(xué)的方法,殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體,即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒,它指殺死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再發(fā)生危害作用,顯然經(jīng)過(guò)消毒,許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會(huì )完全殺死,即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著(zhù)的微生物,所以通過(guò)嚴格滅菌的操作空間(接種、超凈臺等)和使用的器皿,以及操作者的衣著(zhù)和手都不帶任何活著(zhù)的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作,就叫做無(wú)菌操作。

  植物組織培養對無(wú)菌條件的要求是非常嚴格的,甚至超過(guò)微生物的培養要求,這是因為培養基含有豐富的營(yíng)養,稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的,必須根據不同的對象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌,才能保證培養時(shí)不受雜菌的影響,使試管苗能正常生長(cháng)。

  常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類(lèi),即:物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線(xiàn)處理(紫外線(xiàn)、超聲波、微波)、過(guò)濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等措施;化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。

  1.培養基用濕熱滅菌

  培養基在制備后的24小時(shí)內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是:在密閉的蒸鍋內,其中的蒸汽不能外溢,壓力不斷上升,使水的沸點(diǎn)不斷提高,從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下,鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下,可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。

  注意完全排除鍋內空氣,使鍋內全部是水蒸氣,滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法,但目的都是要排凈空氣,使鍋內均勻升溫,保證滅菌徹底。常用方法是:關(guān)閉放氣閥,通電后,待壓力上升到0.05MPa時(shí),打開(kāi)放氣閥,放出空氣,待壓力表指針歸零后,再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后,壓力表上升達到0.1MPa時(shí),開(kāi)始計時(shí),維持壓力0.1~0.15MPa,20分鐘。

  按容器大小不同,保壓時(shí)間有所不同。如果容器體積較大,但是放置的東西數量很少,也可以減少時(shí)間。
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